Кветиапин (сероквель, кетилепт, лаквель, квентиакс, кветирон, нантарид, кетиап, сервитель, кветипин, кетипинор, кутипин, кветиксол)

нажмите, чтобы увидеть

Принятая рукопись

Название: Кветиапин индуцирует некроптотическую гибель клеток миокарда через двунаправленную регуляцию каннабиноидных рецепторов

Авторы: Xiaoqing Li, Zhao Peng, Yiling Zhou, Jing Wang, Xinyi Lin, Xiaoru Dong, Xiaochen Liu, Jieqing Jiang, Yan Jiang, Liliang Li

PII: (19)30176-6
DOI :https://doi.org/10.1016/j.toxlet.2019.06.005
Ссылка: TOXLET10505

Появится в журнале : Toxicology Letters

Датапоступления: 18марта 2019 г.
Датапересмотра: 13июня 2019 г.
Датапринятия: 16июня 2019 г.

Пожалуйста, цитируйте эту статью как: Li X, Peng Z, Zhou Y, Wang J, Lin X, Dong X, Liu X, Jiang J, Jiang Y, Li L, Quetiapine induces myocardial necroptotic cell death through bidirectional regulation of cannabinoid receptors, Toxicology Letters (2019), https://doi.org/10.1016/j.toxlet.2019.06.005.

Это PDF-файл неотредактированной рукописи, которая была принята к публикации. В качестве услуги для наших клиентов мы предоставляем эту раннюю версию рукописи. Перед публикацией в окончательном виде рукопись будет подвергнута копированию, верстке и рецензированию полученного пробного варианта. Пожалуйста, обратите внимание, что в процессе подготовки могут быть обнаружены ошибки, которые могут повлиять на содержание, и к ним относятся все юридические оговорки, которые применяются к журналу.


Кветиапин вызывает некроптотическую гибель клеток миокарда через двунаправленную регуляцию каннабиноидных рецепторов


Xiaoqing Lia , Zhao Penga , YilingZhoua , Jing Wanga , Xinyi Lina , Xiaoru Donga , XiaochenLiua ,
JieqingJianga , Yan Jiang a,* , Liliang Li a,*


aОтделение судебной медицины, Школа фундаментальных медицинских наук, Фуданьский университет, Шанхай, 200032, Китай



Электронные письма:
Сяоцин Ли, lixq15@fudan.edu.cn; Чжао Пэн, zpeng15@fudan.edu.cn; Илин Чжоу, ylzhou14@fudan.edu.cn; Цзин Ван, wangj16@fudan.edu.cn; Синьи Линь, linxy16@fudan.edu.cn; Сяору Дун, xrdong16@fudan.edu.cn; Сяочен Лю, xcliu18@fudan.edu.cn; Цзецин Цзян, jieqing315@fudan.edu.cn; Ян Цзян, jiangyan@fudan.edu.cn; Лилианг Ли, liliangli11@fudan.edu.cn.

*Корреспондирующие авторы: Д-р Янь Цзян, кафедра судебной медицины, Школа фундаментальных медицинских наук, Фуданьский университет. Адрес: 138 Yixueyuan Road, Shanghai 200032, P. R. China. Электронная почта: jiangyan@fudan.edu.cn. Тел: +86-21-54237403. Факс: +86-21-64044561. Д-р Лилианг Ли, кафедра судебной медицины, Школа фундаментальных медицинских наук, Фуданьский университет. Адрес: 138 Yixueyuan Road, Shanghai 200032, P. R. China. Электронная почта: liliangli11@fudan.edu.cn. Тел: +86-21-54237508. Факс:
+86-21-64044561.


Основные моменты

* Кветиапин значительно индуцировал некроптоз



Сокращения: Que - кветиапин; Clz - клозапин; Olz - оланзапин; Rimo - римонабант; RIP1 - рецептор-взаимодействующая серин/треониновая протеин-киназа 1; RIP3 - рецептор-взаимодействующая серин/треониновая протеин-киназа 3; MLKL, mixed lineage kinase domain-like protein; Nec-1, necrostatin-1; CBR, cannabinoid receptor; CB1R, cannabinoid receptor 1; CB2R, cannabinoid receptor 2; AEA, anandamide; 2-AG, 2-arachidonoylglycerol.


* Антагонисты CB1R или агонисты CB2R подавляли некроптоз

* Антагонисты CB1R или агонисты CB2R защищали от кардиотоксичности кветиапина





Аннотация
Кветиапин - распространенный атипичный антипсихотик, применяемый для лечения психических расстройств, таких как шизофрения, биполярное расстройство и большое депрессивное расстройство. В последнее время появляется все больше сообщений, описывающих его кардиотоксичность. Однако молекулярные механизмы, лежащие в основе вызванного кветиапином повреждения миокарда, остаются практически неизвестными. Здесь мы сообщаем о новом типе клеточной смерти,
Кветиапин-индуцированный некроптоз, который объясняет кардиотоксичность кветиапина у мышей, и предложил новые терапевтические стратегии. В сердцах, обработанных кветиапином, после 21-дневного непрерывного введения наблюдалась воспалительная инфильтрация и выраженный фиброз. Специфическое повышение уровня белков RIP3, MLKL и фосфорилирование MLKL показали, что кветиапин индуцирует некроптотическую гибель клеток как in vivo, так и in vitro. Фармакологическая блокада некроптоза с помощью его специфического ингибитора некростатина-1 ослабила вызванное кветиапином повреждение миокарда у мышей. Кроме того, кветиапин нарушал баланс эндоканнабиноидной системы и вызывал противоположные эффекты на два каннабиноидных рецептора (CB1R и CB2R). Специфические антагонисты CB1R (AM 281, Rimonabant), но не его агонист ACEA, значительно улучшали гистопатологию сердца, вызванную хроническим воздействием кветиапина. Напротив, специфические агонисты CB2R (JWH-133, AM 1241), но не его антагонист AM 630, оказывали благоприятное воздействие на кардиотоксичность кветиапина. Защитные агенты (AM 281, римонабант, AM 1241 и JWH-133) последовательно инактивировали сигналы некроптоза, индуцированные кветиапином. Кветиапин двунаправленно регулирует каннабиноидные рецепторы и индуцирует некроптоз миокарда, что приводит к кардиотоксическим эффектам. Поэтому фармакологическое ингибирование CB1R или активация CB2R представляют собой перспективные терапевтические стратегии против кардиотоксичности, вызванной кветиапином.

Ключевые слова: антипсихотики; кветиапин; эндоканнабиноидная система; некроптоз; кардиотоксичность

1. Введение
Атипичные антипсихотики, включая клозапин (Clz), оланзапин (Olz) и кветиапин (Que), являются распространенными препаратами для лечения таких психических расстройств, как шизофрения, биполярное расстройство и большое депрессивное расстройство. Кветиапин, химически схожий с Clz и Olz, был одобрен в 1997 году на основании клинических испытаний у пациентов с шизофренией. По данным компании Astra Zeneca, кветиапин применяют более 22 миллионов человек по всему миру, и он является самым назначаемым атипичным антипсихотиком в Соединенных Штатах (Traynor, 2009). Кветиапин эффективен при остром и поддерживающем лечении большого депрессивного расстройства и генерализованного тревожного расстройства - двух психотропных заболеваний, гораздо более распространенных, чем шизофрения или биполярное расстройство. Однако советники Управления по контролю за продуктами и лекарствами США (FDA) опасаются расширять применение кветиапина из-за его потенциальных побочных эффектов, особенно проблем с обменом веществ, поздней дискинезии и внезапной сердечной смерти (Traynor, 2009).
На сегодняшний день появляется все больше сообщений о том, что клиническое применение Que сопровождается побочными эффектами со стороны сердечно-сосудистой системы или даже приводит к внезапной сердечной смерти (Vieweg, 2003). По сравнению с лицами, не принимавшими препарат, риск внезапной сердечной смерти при приеме Que был повышен на 72 % (ОР=1,72, 95% ДИ: 1,33-2,23) (Salvo et al., 2016). Это совпадает с результатами другого популяционного исследования, в котором было установлено, что прием антипсихотического препарата, такого как Que, ассоциируется с 1,53-кратным увеличением риска желудочковой аритмии и/или внезапной сердечной смерти. Более того, во временных интервалах 7, 14 и 28 дней вышеуказанная связь была значительно выше среди тех, у кого
кратковременное употребление (Wu et al., 2015). Патологическая основа, лежащая в основе клинически и судебно наблюдаемой аритмии, в значительной степени объяснялась расстройством сердечной мышцы, вызванным Que (Coulter et al., 2001). По данным программы международного мониторинга лекарственных средств Всемирной организации здравоохранения, миокардит и кардиомиопатия, вызванные Que, были распространенным проявлением патологии. О миокардите и кардиомиопатии, связанных с приемом Que, сообщалось в единичных случаях, и эти случаи могут быть иногда интригующими, имитирующими острый инфаркт миокарда с повышением сегмента ST на практике (Roesch-Ely et al., 2002; Wassef et al., 2015). Широкие сообщения о побочных эффектах со стороны сердечно-сосудистой системы также вызвали обеспокоенность со стороны Датского медицинского агентства и Европейского медицинского агентства, которые, соответственно, опасаются расширять применение Que (Jakobsen et al., 2017; Lee et al., 2013). Эти данные свидетельствуют о том, что повреждение миокарда, вызванное Que, требует дальнейшего клинического и экспериментального изучения.
Хотя кардиотоксичность Que хорошо известна, глубокое изучение этого побочного эффекта с помощью экспериментальных

Доказательства остаются в основном пустыми. Поскольку основное воздействие лекарственной токсичности заключается в гибели клеток (Linkermann and Green, 2014), необходимо срочно выяснить причины гибели кардиомиоцитов, вызванной Que, и механизмы ее регулирования.
Некроптоз - это недавно определенный тип запрограммированной некротической смерти клеток, который, как было доказано, является как причиной, так и следствием заболеваний (Linkermann and Green, 2014). Эта форма клеточной смерти запускается важным медиатором - рецептор-интерактивной протеинкиназой 3 (RIP3), которая активируется рецептор-интерактивной серин/треониновой протеинкиназой 1 (RIP1) при фосфорилировании и каскадно фосфорилирует нижележащий домен киназы смешанной линии, подобный белку (MLKL), что приводит к транслокации p-MLKL на клеточную мембрану и, следовательно, на плазматическую мембрану.
образование пор (Gong et al., 2017). Помимо повреждения целостности мембраны, в результате

Некротикоподобная клеточная смерть также характеризуется избытком аутофагии, потерей функции митохондрий и генерацией реактивных видов кислорода (Xie et al., 2015). Хотя некроптоз и апоптоз - обе формы запрограммированной клеточной гибели, они имеют много различий в морфологическом виде и молекулярных путях. Апоптоз имеет общие морфологические признаки, включая кровоизлияния, конденсацию хроматина, фрагментацию ядер, потерю адгезии и округление (в адгезивных клетках), а также уменьшение размеров клеток. В то же время при апоптозе клеток активируется путь, опосредованный каспазой-3, что приводит к активации Bax и Bcl-2. В отличие от апоптоза, опосредованного каспазой-3, некроптоз приводит к гибели клеток через RIR1/RIP3/MLKL-сигнализацию, и некроптотические клетки демонстрируют морфологические признаки, сходные с некрозом, а именно: набухание клеток, дисфункцию органелл и разрыв плазматической мембраны (Weinlich et al., 2017). Хотя некроптоз, возможно, развивался как линия защиты от внутриклеточной инфекции, недавние исследования указывают на его участие в различных заболеваниях (Linkermann and Green, 2014).
токсичность, вызванную лекарственными препаратами (Takahashi et al., 2012). Некроптотическая гибель клеток лежит в основе лекарственно-индуцированной гибели

В результате HMGB1-индуцированной кардиотоксичности, вызванной химиотерапевтическим препаратом дазатиниб, кардиомиоциты подвергаются некропсии. В частности, на кардиомиоциты химиотерапевтический препарат дазатиниб, вызывающий кардиотоксичность, действует через приведение кардиомиоцитов к HMGB1-опосредованному некроптозу (Xu et al., 2018). Было обнаружено, что медиаторы некроптоза RIP1/RIP3 высоко экспрессируются в кардиомиоцитах при остром вирусном поражении, а фармакологическая блокада пути некроптоза с помощью специфического блокатора некростатина-1 (Nec-1) значительно уменьшает повреждение миокарда (Xu et al,
2018).

Ранее мы сообщали, что Que, а также другие антипсихотики Clz, Olz и хлорпромазин, при приеме этих препаратов ассоциируются с заболеваниями, сопровождающимися воспалением (например, пневмонией или миокардитом) (Li et al., 2018). Кардиотоксичность, вызванная клозапином, оказывала противоположное влияние на экспрессию каннабиноидных рецепторов (CB1R ad CB2R) (Li et al., 2019). Целью настоящего исследования было изучить побочные эффекты на сердце после применения Кве на экспериментальной мышиной модели.
Гибель клеток, вызванная кветиапином, оценивалась системно, и на основании этой оценки мы оценили потенциал антагонистов/антагонистов каннабиноидных рецепторов в восстановлении гибели кардиомиоцитов, вызванной Que. Наши данные представляют собой первое, насколько нам известно, экспериментальное доказательство связи кардиотоксичности Que с индуцированной некроптотической гибелью клеток, и мы предположили, что селективные антагонисты CB1R или агонисты CB2R открывают полезные ключи к кардиотоксическим эффектам Que путем ингибирования некроптоза.

2. Материалы и методы

2.1. Эксперименты на животных

Все эксперименты с животными проводились в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных NIH (публикация NIH № 85-23, пересмотренная в 1996 г.). Протоколы экспериментов на животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных при Школе фундаментальных медицинских наук Фуданьского университета (№: 20170223-004). Все усилия были направлены на то, чтобы свести к минимуму страдания животных.
Самцы мышей Balb/C в возрасте ~ 4 недель были приобретены у компании SLAC Inc. (Шанхай, Китай) и привыкали в течение 1 недели. Все мыши были размещены в стерильных условиях для разведения лабораторных животных и содержались при подходящей температуре с чередованием 12-часового цикла свет-темнота. Пища и вода были доступны для них. В 15:00 каждого дня мышам внутрибрюшинно вводили 100 мкл транспортного средства (PBS) (контрольная группа, Ctrl) или Que (60 мг/кг). В рамках эксперимента некоторые группы мышей получали ингибиторы, которые предварительно вводили примерно за 1 ч до инъекции Que или PBS (см. блок-схему на рис. 1А). Вес мышей регистрировали ежедневно до инъекции, если не указано иное. Количество мышей составляло 5-6 на группу, как указано в легенде каждого рисунка. Лечение продолжалось 21 день подряд. На 21-й день у всех мышей была взята кровь через глазную вену для приготовления образцов сыворотки, в это же время были измерены длина голени (ДГ) и вес сердца (ВС).
Сердца были поперечно рассечены, часть тканей сердца подвергнута фиксации в формалине и

Парафиновые вставки для нарезки сердца. Оставшиеся ткани сердца хранились при температуре -80? до использования.

2.2. Гистологическое исследование

Срезы сердца окрашивали гематоксилином и эозином (HE) и PicroSirius Red (PSR) для гистологического наблюдения воспалительных инфильтратов и фибротических поражений, соответственно. В рамках данного исследования миокардит определялся как ?1 скопление воспалительных клеток, при этом в каждом скоплении должно быть не менее 10 клеток. Воспалительные инфильтраты классифицировали по степени клеточной инфильтрации и оценивали по 5-балльной шкале от 0 до 4+ (индекс инфильтрации воспаления), как мы описали ранее (Li et al., 2019): 0 - отсутствие или сомнительная выраженность; 1+ - 1-2 очага; 2-3+ - промежуточная выраженность с мультифокальными поражениями; 4+ - коалесцентные и обширные поражения по всей исследуемой ткани сердца. Редкая инфильтрация воспалительными клетками также оценивалась как 4+.
После окрашивания PSR для количественной оценки степени фиброза выбирали и фотографировали по 5 полей из каждой группы сердец мышей. Площадь фиброза автоматически анализировали в соотношении с площадью среза с помощью программы Image J (Национальный институт здоровья, Бетесда, MD, США). Мультиплексный анализ иммуногистохимии (ИГХ) проводили с помощью набора OpalTM multicolor IHC kit (PerkinElmer Inc., Boston, MA, USA) в соответствии с предыдущим описанием (Stack et al., 2014). Первичное антитело RIP3 (Catalog No.: 17563-1-AP) и моноклональное антитело MLKL (Catalog No.: 66675-1-Ig) были приобретены в компании Proteintech (Rosemont, IL, USA) и инкубированы со срезами сердца. RIP3 и MLKL визуализировались розовым и коричневым сигналами, соответственно.
2.3. Антитела

Первичные кроличьи моноклональные антитела против CB1R (номер по каталогу: 93815) и RIP1 (номер по каталогу: 3493) были приобретены у Cell Signaling Technology (Бостон, MA, США). Первичные кроличьи антитела анти-Bax (Catalog No.: 2272) и анти-GAPDH (Catalog No.: 5174) также были приобретены у Cell Signaling Technology. Первичное кроличье поликлональное анти-CB2R антитело было приобретено у Gene Tex Inc. (Catalog No.: GTX23561, Irvine, CA, USA). Первичные кроличьи моноклональные антитела против LC-3B (Catalog No.:192890) и фосфорилированного MLKL (S345) (Catalog No.: 196436) также были приобретены у Abcam. Первичные антитела против каспазы 3 (Catalog No.: 19677-1-AP), Bcl-2 (Catalog No.: 12789-1-AP), RIP3 (Catalog No.:17563-1-AP), MLKL (Catalog No.:66675-1-Ig и 21066-1-AP),
Беклин 1 (номер по каталогу: 11306-1-AP) и RIP 1 (номер по каталогу: 17519-1-AP) были приобретены у компании

Proteintech Inc. (Роузмонт, ИЛ, США). Моноклональное антитело мыши против ?-активина было приобретено

от Santa Cruz Biotechnology (Catalog No.: sc-47778, Santa Cruz, CA, USA). HRP-связанные вторичные антитела были приобретены у Jackson laboratories Inc. (West Grove, PA, USA). Козье антирабическое вторичное антитело Alexa Fluor 555 (номер по каталогу: A-21428) и Alexa Fluor 488 (номер по каталогу: A-11008) были приобретены у Invitrogen Inc. (Carlsbad, CA, USA). Применение всех первичных антител в настоящих анализах было подтверждено производителями.
2.4. Химикаты и растворы

Антипсихотик Clz был приобретен у компании Sigma-Aldrich (Сент-Луис, МО, США). Клозапин растворяли в 0,1 М HCl и выравнивали рН в фосфатном буферном солевом растворе (PBS), чтобы получить исходный раствор Clz (80 мМ). Затем исходный раствор разбавляли в зависимости от используемой дозы. Селективный CB1-антагонист римонабант (Rimo) и селективный CB2-антагонист AM 630 были коммерчески получены от
Sigma-Aldrich. Селективный антагонист CB1 AM 281 (Catalog No.:B6603) и селективный агонист ACEA (Catalog No.: 1319) были приобретены у APExBio Technology (Boston, MA, USA) и Tocris Bioscience (Abingdon, OX, UK), соответственно. Другой CB2-агонист JWH-133 был приобретен у MedChemExpress (Catalog No.: 259869-55-1, Monmouth Junction, NJ, USA). ACEA, Rimo и AM 630 были приготовлены в виде рабочих растворов 1 мг/мл, 0,6 мг/мл и 1 мг/мл, соответственно, в растворителях, состоящих из ДМСО, Tween-20 и PBS. Селективный CB2-агонист AM 1241 был приобретен у Selleck Chemicals (Houston, TX, USA) и приготовлен в виде рабочего раствора 10 мг/мл в растворителях, состоящих из ДМСО и PBS. Наибольшая конечная концентрация ДМСО во внешнем растворе составляла ?1%, и эта концентрация не влияла на выживаемость мышей. Кветиапин фумарат и Олз (каталожный номер: S2493) были приобретены у компании Selleck Chemicals и растворены в физиологическом растворе с добавлением 1% уксусной кислоты для получения исходных растворов (12 мг/мл, 0,5 мг/мл, соответственно). Некростатин-1 (Nec-1) был приобретен у Santa Cruz Biotechnology (Catalog No.: 4311-88-0) и был растворен до 1 мг/мл для рабочей концентрации. Конечные дозы для экспериментов in vivo составляли Rimo (3 мг/кг), AM 281 (2,5 мг/кг), ACEA (5 мг/кг), AM 1241 (5 мг/кг), JWH-133 (5 мг/кг) и AM 630 (5 мг/кг), соответственно.
2.5. Культура клеток

Клетки миокарда HL-1 были получены в нашей лаборатории и культивировались в модифицированной среде орла Дульбекко (DMEM), дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS). Для моделирования токсичности Que in vitro клетки HL-1 обрабатывали различными дозами Que от низкой (LD, 1 мкМ), средней (MD, 2 мкМ) до высокой (HD, 4 мкМ) в инкубаторе при 37? в течение 24 ч. Клетки были

также обрабатывали фиксированной дозой (2 мкМ), но экспозиция Que длилась 0, 2, 4, 8, 12, 24 и 36 ч соответственно. Для оценки влияния Nec-1 (60 мкМ) или агентов CBRs на токсичность Que клетки HL-1 предварительно обрабатывали Nec-1 или указанными модуляторами CBRs. Конечные дозы Nec-1 (60 мкМ), Rimo (2 мкМ), AM 281 (2 мкМ), AM 1241 (5 мкМ), JWH-133 (1 мкМ) вносили в среду за 30 мин до введения Que.
2.6. Вестерн-блот анализ

Культуры кардиомиоцитов лизировали с помощью RIPA-буфера (Beyotime, Наньтун, Китай), смешанного с коктейлем ингибиторов протеаз/фосфатаз (Cell Signal Technology). Общий белок определяли количественно с помощью набора BCA (Thermo Scientific, CA, США) в соответствии с протоколом производителя. Равное количество белка загружали в каждую полосу на 10 % SDS-PAGE геле и переносили на поливинилиденфторидную (PVDF) мембрану. Затем мембраны блокировали в 5% обезжиренном молоке, растворенном в трис-буферном солевом растворе с 0,1% Tween-20 (TBST), в течение 1 ч при комнатной температуре, зондировали первичным белком.
антитела, в том числе в течение ночи при 4?. Затем пробирки дважды промывали в TBST и инкубировали с вторичным антителом (1:50 000, Jackson Laboratories), разведенным в 5% молоке, в течение 1 ч. ?-актин синхронно определяли в качестве контроля загрузки. Интенсивность определяли с помощью программы Image J и нормировали на ?-актин или ATP1?1, как указано.
2.7. Выделение мембранных, ядерных и цитоплазматических белков

Для анализа субклеточных компонентов мембранные, ядерные и цитоплазматические белки выделяли с помощью коммерческого набора от Sangon Biotech (Catalog No.: C510002, Shanghai, China) в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, с помощью реагента для извлечения белка из клеточной пульпы, клетки полностью раздували и разрушали клеточную мембрану, чтобы высвободить цитоплазматический белок. Затем ядерные белки собирали из надосадочной жидкости после центрифугирования при 4°C, 12000 об/мин в течение 10 мин. Затем осадки разбивали с помощью ультразвука и получали мембранный белок после центрифугирования при 4°C, 12000 об/мин в течение 10 мин.
2.8. Иммунофлуоресцентный анализ

Клетки миокарда мыши HL-1 культивировали в 24-луночных планшетах и получали обработку Que (конечная концентрация = 2 мкМ) отдельно или в сочетании с совместной инкубацией с указанными агентами. После 24 ч инкубации клетки фиксировали чистым ацетоном в течение 10 минут и трижды промывали ледяным PBS. После

После блокирования козьей сывороткой в течение 1 ч клетки инкубировали с первичным антителом против MLKL при 4°C в течение ночи. В качестве вторичного антитела использовали Alexa Fluor goat anti-mouse IgG. DAPI контрастировали при разведении 1:1000 в течение 10 минут при комнатной температуре.
2.9. Трансмиссионный электронный микроскоп

Клетки миокарда HL-1 инкубировали с Que (2 мкМ) или PBS в течение 24 ч в 6-сантиметровом блюде. Затем культуральную среду удаляли, а клетки трипсинизировали и осаждали центрифугированием при 1000 об/мин в течение 5 мин. Затем осадки клеток погружали в 2%-ный глутаральдегид. Изображения были получены с помощью просвечивающего электронного микроскопа (ПЭМ) (FEI/PHILIPS CM120 TEM, Philips Electron Optics B.V.).
2.10. Анализ жизнеспособности клеток

Для оценки влияния Que на жизнеспособность клеток миокарда клетки высевали в 96-луночные планшеты и обрабатывали, как указано. Количество клеток контролировали путем определения абсорбции в каждой лунке. В каждой временной точке аликвоту 10 мкл раствора CCK-8 (Beyotime, Наньтун, Китай) добавляли в лунку.
культуральной среды. Затем клетки повторно инкубировали при 37? в течение еще 2 часов. Абсорбция при длине волны 450 нм (OD450) определялась на микропланшетном ридере (BioTek, Winooski, VT, США).
2.11. Определение уровня основных эндоканнабиноидов с помощью ЖХ-МС/МС

Клетки миокарда HL-1 культивировали в 6-луночных планшетах и обрабатывали Que(2 мкМ) в течение 24 ч, когда клетки достигали ~80% конфлюэнтности. После экстракции липидов из культивируемых клеток или образцов сыворотки уровень анандамида (AEA) и 2-арахидоноилглицерина (2-AG) определяли методом ЖХ-МС/МС, как мы описали ранее (Dong et al., 2018).
2.12. Статистический анализ

Данные представлены в виде среднего ± стандартная ошибка среднего (SEM). Для сравнения средних между группами использовали t-тест Стьюдента, а для сравнения ?3 групп - односторонний дисперсионный анализ (ANOVA) с последующим пост-хок тестом наименьших значимых различий (LSD). При анализе ANOVA сначала анализировали нормальное распределение, а затем, при необходимости, использовали тест Брауна-Форсайта для анализа однородности дисперсии. Статистически значимым считалось значение p менее 0,05.

3. Результаты



3.1. Хроническое воздействие Que вызывает кардиотоксичность in vivo и in vitro

Антипсихотики, по многочисленным данным, удлиняют скорректированный интервал QT в клинике или даже приводят к внезапной сердечной смерти (Wu et al., 2015). О гистопатологии кардиотоксичности Que сообщается крайне редко. В данном экспериментальном исследовании мы использовали 60 мг/кг Que - дозу, сопоставимую с клинической для поддержания здоровья, - для внутрибрюшинного введения мышам. Во время непрерывного лечения у мышей, получавших Que, не наблюдалось значительных изменений массы тела по сравнению с аналогами, получавшими PBS (рис. 1B). Отношение массы сердца к длине голени (HW/TL) является показателем, отражающим интерстициальный отек и патологию сердца.
Расчет HW/TL показал, что он значительно увеличивался примерно в 2 раза после хронического лечения Que (рис. 1С). Сердца мышей были собраны для гистологического анализа. В отличие от
В контрольном сердце, обработанном PBS, окрашивание HE показало, что в сердце, обработанном Que, наблюдалось от очагового до многоочагового скопления воспалительных клеток (рис. 1D, окрашивание HE). Окрашивание PSR (400X) также показало, что фиброзные ткани значительно накапливались как в периваскулярных, так и в интерстициальных областях сердца, обработанного Que (рис. 1D, окрашивание PSR). Индекс воспалительной инфильтрации значительно увеличился по сравнению с контрольными мышами (рис. 1E, верхняя панель, p<0,01). Количественная оценка фиброза показала, что площадь фиброзных тканей в сердцах, облученных Que, примерно в 3 раза превышала таковую в контрольных сердцах без Que (рис. 1E, нижняя панель, p<0,001). В культивированных кардиомиоцитах трансмиссионный электронный микроскоп показал, что контрольные клетки имели нормальную субклеточную структуру, в то время как в клетках, обработанных Que, наблюдались дезинтеграция клеточной мембраны, набухание митохондрий и расширение ретикулума (рис. 1F). Кроме того, гибель клеток, вызванная Que, была дозозависимой (рис. 1G) и зависимой от времени (рис. 1H), что соответствует клиническим наблюдениям о том, что длительный прием Que или более высокие дозы предрасполагают к кардиотоксичности (Adameova et al., 2017). Все эти результаты свидетельствовали о том, что Que действительно вызывал кардиотоксичность.




Рис. 1. Кветиапин (Que) индуцировал повреждение миокарда in vivo и in vitro. (A) Блок-схема эксперимента. (B) Ежедневно отслеживали массу тела у мышей, получавших Ctrl или Que. (C) Соотношение HW/TL рассчитывали после 21-дневного непрерывного лечения (n=6/группа). (D) В сердцах, обработанных кветиапином, наблюдалась выраженная воспалительная инфильтрация (окрашивание HE) и фиброз как в периваскулярных, так и в интерстициальных областях (окрашивание PSR). (E) Лечение кветиапином значительно увеличило индекс воспалительной инфильтрации (n=6/группа) и процент фиброза (%) (n=5/группа). (F) Трансмиссионный электронный микроскоп (ТЭМ) показал, что контрольные кардиомиоциты имеют нормальную субклеточную структуру, в то время как клетки, подвергшиеся воздействию кветиапина, имеют дезинтеграцию клеточной мембраны и митохондрий.
набухание. (G) Серийные дозы Que добавлялись к клеткам миокарда HL-1, и проводился мониторинг жизнеспособности клеток.

с помощью набора CCK-8 после 24 ч инкубации. Значение F составило 1,353, а значение p - 0,2488 для

Тест Брауна-Форсайта на однородность дисперсии. EC50 составляет 104,12 мкМ. (H) Кветиапин (2 мкМ) инкубировали с клетками HL-1 в течение нескольких часов (0 ч, 2 ч, 4 ч, 8 ч, 12 ч и 24 ч). Жизнеспособность клеток оценивали с помощью набора CCK-8. Значение F составило 0,3818, а p - 0,8502 для теста Брауна-Форсайта.

однородность дисперсии. Ctrl - контроль. Que - кветиапин. HW/TL - вес сердца/длина голени. HE, гематоксиклин и эозин. PSR, PicroSirius Red. *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001 по сравнению с Ctrl.

3.2. Кветиапин индуцирует некроптоз клеток кардиомиоцитов

Учитывая, что Que вызывал набухание митохондрий, дезинтеграцию клеточной мембраны и расширение ретикулума, была выдвинута гипотеза, что Que предрасполагает клетки к некротикоподобной гибели. Некроптоз характеризуется каскадной активацией RIPs и фосфорилированием MLKL, которые в конечном итоге транслоцируются на клеточную мембрану и приводят к образованию пор (Cai et al., 2014). Вначале мы обработали кардиомиоциты тремя распространенными атипичными антипсихотиками (Clz, Olz и Que) и определили активацию некроптоза. Результат показал, что Que оказывал последовательное промотирующее действие на сигнальные белки некроптоза, а также фосфорилирование MLKL (рис. 2A), что свидетельствует о том, что Que может индуцировать некроптоз клеток. Затем мы инкубировали миокардиальные клетки HL-1 с Que в разных дозах (рис. 2В) или в течение разных часов (рис. 2С). Активация некроптоза, вызванная Que, была дозовой и
зависимо от времени. Для изучения активации некроптоза в сердцах мышей был проведен мультиплексный IHC-анализ с совместным окрашиванием RIP3 и MLKL (рис. 2D). Было видно, что RIP3 (розовый) и MLKL (коричневый) резко увеличились в миокарде, и, что важно, MLKL транслоцировался из цитоплазмы в интактном сердце в клеточную мембрану в сердце, подвергшемся Que-инсульт (рис. 2D).
Кветиапин-индуцированная транслокация MLKL была дополнительно подтверждена иммунофлуоресцентным окрашиванием клеток (рис. 2E). Подсчет клеток с цитомембраной, собирающей MLKL, показал, что после 24 ч воздействия Que увеличил процент клеток с мембранной MLKL-позитивной локализацией примерно в 5 раз (рис. 2F). Эти наблюдения позволили предположить, что Que индуцирует некроптотическую гибель клеток, вызывая побочные сердечные эффекты.




Рис. 2. Кветиапин (Que) индуцировал некроптотическую гибель клеток в сердцах. (A) Вестерн-блот анализ выявил медиаторы, связанные с некроптозом, в клетках HL-1, обработанных Ctrl, Clz (40 мкМ), Olz (1 мкМ) и Que (2 мкМ). Количественная оценка интенсивности блотов приведена на правой панели. Кветиапин вызывал последовательное повышение уровней RIP1, RIP3, MLKL и p-MLKL среди всех препаратов. (B) Кветиапин в диапазоне доз от 1 мкМ (низкая доза, LD) до 4 мкМ (высокая доза, HD) постепенно повышал уровни RIP1, RIP3, MLKL и p-MLKL после 24 ч лечения. Средняя доза (MD) Que (2 мкМ) приводила к наибольшей активации некроптоза. На правой панели показаны количественные данные после анализа интенсивности в ImageJ. (C) Кветиапин (2 мкМ) повышал уровни RIP1, RIP3, MLKL и p-MLKL в клетках HL-1 при увеличении длительности лечения (2, 4, 8, 12, 24 и 36 ч). Количественную оценку каждого блота проводили с помощью программы ImageJ. (D) Мультиплексный IHC-анализ RIP3 (розовый) и MLKL (коричневый) в срезах сердца мышей, обработанных Ctrl или Que (60 мг/кг).

MLKL транслоцировался из цитоплазмы в сердце Ctrl в клеточную мембрану в сердце, обработанном Que (черная стрелка), в то время как RIP3 имел высокую экспрессию исключительно в сердце, обработанном Que. (E) Иммунофлуоресцентный анализ выявил
локализация МЛКЛ в клетках миокарда HL-1, обработанных Ctrl или Que (2 мкМ). Для выявления клеточного ядра использовалось совместное окрашивание DAPI. Увеличение: 400?. (F) Некроптотические клетки обозначались как клетки с мембраной, собирающей MLKL.
Процент некроптоза клеток рассчитывали как количество некроптотических клеток среди всех клеток (DAPI-позитивных клеток). Ctrl - контроль. Clz - клозапин. Olz - оланзапин. Que - кветиапин. *, p<0,05; **, p<0,01 по сравнению с Ctrl.
3.3. Кветиапин оказывал минимальное влияние на апоптоз и аутофагию клеток

Далее было исследовано влияние Que на другие типы гибели клеток. Клетки инкубировали в тех же условиях, что и выше. Маркеры апоптоза клеток, такие как каспаза 3 и Bcl-2, оставались стабильными при обработке Que. Проапоптотический Bax, как правило, дозозависимо увеличивался, но оставался неизменным в течение нескольких часов обработки (рис. 3A и 3B). Преобразование LC3B-I в LC3B-II является маркером активации аутофагии (Cai et al., 2014). Было замечено, что уровень LC3B-II не увеличивался на
При обработке Que. Напротив, он имел тенденцию к снижению при увеличении дозы Que или продлении времени инсульта (рис. 3C-3D). Беклин 1 также не претерпел заметных изменений во всех группах (рис. 3C и 3D).
В совокупности с приведенными выше данными можно сделать вывод, что Que стабильно индуцирует некроптоз клеток.







Рис. 3. Кветиапин (Que) оказывал минимальное влияние на апоптоз и аутофагию кадиомиоцитов. (A, B) Кардиомиоциты подвергались воздействию низкой (LD, 1 мкМ), средней (MD, 2 мкМ) и высокой (HD, 4 мкМ) доз кветиапина.
Que, соответственно, или обрабатывали постоянной дозой Que (2 мкМ) в течение разных часов. Определяли маркеры апоптоза клеток, включая каспазу 3 (как расщепленную форму, так и ее общий уровень), Bax и Bcl-2. (C, D) Кардиомиоциты обрабатывали, как указано выше. Определяли маркеры аутофагии, включая LC3B и Beclin 1. Каждый блот
Количественная оценка была проведена с помощью программы ImageJ и показана на нижних панелях. *, p<0,05 по сравнению с Ctrl.

3.4. Фармакологическое ингибирование некроптоза защищает от кардиотоксичности Que

Некростатин-1 (Nec-1) - общепризнанный ингибитор некроптоза, который специфически подавляет активацию RIP1 (Szobi et al., 2016). Эффективность Nec-1 для блокирования некроптоза была также проверена на наших культивированных кардиомиоцитах (рис. 4А). Затем Nec-1 предварительно добавляли мышам каждый раз перед началом
инъекции Que. По окончании лечения срезы сердца были подвергнуты гистологическому исследованию и

Было показано, что Nec-1 заметно смягчает Que-индуцированное повреждение миокарда (рис. 4B). Как отражение ослабления патологии сердца, HW/TL значительно снижался в ответ на предварительную обработку Nec-1 (рис. 4C, p<0,01). Индекс воспаления был более мягким (рис. 4D), а накопление фиброза явно уменьшалось под действием предварительной обработки Nec-1 (рис. 4E). Эти данные указывают на то, что ингибирование некроптоза ослабляет кардиотоксичность Que.

Рис. 4. Ингибирование некроптоза смягчало кветиапин (Que)-индуцированную кардиотоксичность. (A) Вестерн-блот анализ подтвердил, что Nec-1 действительно ингибирует процесс некроптоза через блокирование активации RIP1. Интенсивность каждой пробирки оценивали с помощью ImageJ, как показано на правой панели. (B) Мышам, обработанным Que, предварительно вводили
с транспортным средством (Veh, PBS) или Nec-1 (группа Nec-1) за 1 ч до обработки Que. В конце экспериментов сердца мышей

Их разрезали на срезы для гистологического анализа, включая окрашивание HE и окрашивание PSR. Кветиапин-индуцированный

Кардиопатология, включая воспалительную инфильтрацию (окрашивание HE) и накопление фибронектина (окрашивание PSR), была гистологически ослаблена предварительной обработкой Nec-1. (C-E) Влияние предварительной обработки Nec-1 на соотношение HW/TL,
индекс воспалительной инфильтрации и процент фибротической площади (%) в сердцах, подвергшихся воздействию Que (n=5/группа). Nec-1 - некростатин-1. Окрашивание HE - окрашивание гематоксилином и эозином. PSR, PicroSirius Red. HW/TL - отношение веса сердца к длине голени. *p<0,05, **p<0,01, как указано.
3.5. Лечение кветиапином нарушает баланс эндоканнабиноидной системы

Эндоканнабиноидная система, по многочисленным данным, участвует в токсичности лекарств (du Plessis et al., 2015; Fernandez-Ruiz et al., 2015; Gerra et al., 2010). Чтобы выяснить, передают ли каннабиноидные рецепторы (CBRs) внеклеточную токсичность Que на внутриклеточные реакции, мы собрали образцы сыворотки контрольных и обработанных Que мышей и определили уровни анандамида (AEA) и
2-арахидоноилглицерина (2-АГ) с помощью разработанного нами метода ЖХ-МС/МС (Dong et al., 2018). Оказалось, что содержание AEA снижается после воздействия Que (рис. 5A). Содержание 2-АГ, наиболее обогащенного эндоканнабиноида, было значительно снижено у мышей, получавших Que, по сравнению с их сверстниками (рис. 5В). Аналогичным образом, в культивируемых кардиомиоцитах уровень 2-АГ снизился почти на 50 % после 24-часовой обработки Que (рис. 5C). Кроме того, было оценено влияние Que на два подтипа CBRs (CB1R и CB2R). Результаты показали, что общий уровень белка CB1R снижался, а CB2R повышался при увеличении дозы или продолжительности лечения (рис. 5D). CBR функционируют в основном за счет переноса между мембраной и цитоплазмой (Pertwee, 2015). Мембранные и цитоплазматические белки были выделены соответственно и подвергнуты вестерн-блот анализу.
Интересно, что наши результаты показали, что уровень белка CB1R постепенно снижался на клеточной мембране, но перемещался в цитоплазму (рис. 5E). Напротив, уровень CB2R увеличивался на клеточной мембране и значительно снижался в цитоплазме (рис. 5E). Все эти результаты свидетельствуют о том, что Que двунаправленно регулирует два подтипа CBRs в миокарде.




Рис. 5. Хроническое лечение Que нарушает баланс эндоканнабиноидной системы. (A, B) Уровни AEA и 2-AG в сыворотке крови контрольных или обработанных Que (60 мг/кг) мышей с помощью LC-MS/MS (n=5 мышей/группа). (C) Уровни 2-АГ были определены в контрольных и обработанных Que (2 мкМ) кардиомиоцитах HL-1 с помощью ЖХ-МС/МС. (D) Вестерн-блот анализ общего уровня белков CB1R и CB2R в культивируемых клетках HL-1. Количественная оценка каждого блота была проведена с помощью программы ImageJ и показана на нижних панелях. Изменение дозы Que (от 1 мкМ до 4 мкМ) или времени экспозиции (0, 2, 4, 8, 12, 24 и 36 ч) вызывало противоположные эффекты на уровни белков CB1R и CB2R. (E) Субклеточные компоненты HL-1
Клетки были разделены и собраны. Затем проводили блоттинг CB1R и CB2R, расположенных на цитомембране и в цитоплазме. ATP1?1 и ?-актин синхронно определяли в качестве внутреннего контроля для мембраны и плазмы, соответственно. На сайте

Интенсивность блотов была оценена количественно и показана на правых панелях. *, p<0,05; *, p<0,01; ***, p<0,001 по сравнению с Ctrl в группах CB1R и #, p<0,05; ##, p<0,01 по сравнению с Ctrl в группах CB2R.
3.6. Антагонисты CB1R, но не его агонисты облегчали токсические эффекты, вызванные Que

Затем использовали селективные антагонисты CB1R AM 281 и Rimo, а также его агонист ACEA. Предварительная обработка антагонистами CB1R, либо Rimo, либо AM 281 ослабляли гистопатологию, вызванную Que (рис. 6A). Показатель HW/TL значительно снижался после предварительной обработки любым из антагонистов CB1R (рис. 6B).
Воспаление и фиброз также купировались антагонистами CB1R (рис. 6C и 6D). Напротив, предварительная обработка ACEA значительно ухудшала повреждение миокарда, вызванное Que (рис. 6E). Показатели HW/TL были значительно увеличены (рис. 6F), а инфильтрация воспаления, очевидно, способствовала лечению ACEA (рис. 6G). Фиброзные ткани также увеличивались по площади в
Сердца, обработанные ACEA (рис. 6H). Полученные результаты продемонстрировали, что ингибирование CB1R может быть терапевтическим средством против кардиотоксичности Que.




Рис. 6. Фармакологическое ингибирование CB1R защищало от кардиотоксичности Que. (A) В первой экспериментальной группе мышей предварительно обрабатывали PBS, антагонистами CB1R Rimo или AM 281 (n=6 мышей/группа) до начала введения Que
Оскорбление. Через 21 день после лечения мышей приносили в жертву. Для гистологического исследования срезы сердца окрашивали реактивами HE и PSR. Блокада CB1R значительно уменьшала воспалительную инфильтрацию и фиброз сердца. (B) Рассчитывали HW/TL мышей в группах PBS, Rimo и AM 281, получавших лечение. (C, D) Индекс воспаления и процент фиброза рассчитывали для каждой группы мышей. (E) Во втором эксперименте мышей
Предварительно обработанные PBS или специфическим агонистом CB1R ACEA (n=6 мышей/группа) за 1 ч до начала инсульта Que. Для гистологического исследования срезы сердца окрашивали реактивами HE или PSR. (F) Рассчитывали HW/TL для

каждой группы мышей после жертвоприношения. (G, H) Индекс воспаления и степень фиброза рассчитывали для мышей, получавших PBS или ACEA. Римо - римонабант. Окрашивание HE - окрашивание гематоксилином и эозином. PSR, PicroSirius Red. HW/TL - вес сердца/ длина голени. *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, как указано.
3.7. Агонисты CB2R, но не его антагонисты ослабляли токсические эффекты, вызванные Que

Кроме того, были протестированы селективные агонисты CB2R JWH-133 и AM 1241, а также его антагонист AM 630. При предварительном лечении агонистами CB2R JWH-133 или AM 1241 ослабляли гистопатологию, вызванную Que, о чем свидетельствовало окрашивание HE и PSR (рис. 7A). Показатель HW/TL значительно снижался при предварительном лечении любым из агонистов CB2R (рис. 7B). Воспалительная инфильтрация и фиброзное накопление также подавлялись агонистами CB2R (рис. 7C и 7D). И наоборот, предварительная обработка АМ 630, по-видимому, не снимала воспаление, но усугубляла фиброз, вызванный Que, в периваскулярных областях (рис. 7E). Хотя соотношение HW/TL (рис. 7F) и индекс инфильтрации воспаления (рис. 7G) существенно не различались между сердцами с обработкой AM 630 и без нее, степень фиброза значительно ухудшилась в сердцах, обработанных ACEA (рис. 7H). Полученные результаты продемонстрировали, что агонисты CB2R оказывают благоприятное воздействие на кардиотоксичность Que.






Рис. 7. Фармакологическая активация CB2R защищала от кардиотоксичности Que. (А) В первой экспериментальной группе мышей предварительно обрабатывали PBS, агонистами CB2R JWH-133 или AM 1241 (n=6 мышей/группа) до начала инсульта Que. Через 21 день после лечения мышей приносили в жертву. Сердечные срезы окрашивали HE и PSR
реагентов для гистологического исследования. Активация CB2R любым из агонистов значительно уменьшала токсичность миокарда. (B) Влияние агонистов CB2R на соотношение HW/TL. (C, D) Агонисты CB2R вызывали значительное снижение индекса воспаления миокарда и процента фиброза. (E) Во втором эксперименте мышей предварительно обрабатывали PBS или специфическим антагонистом CB2R AM 630 (n=6 мышей/группа) за 1 ч до инъекции Que. Сердечные срезы были
Окрашивали реактивами HE или PSR для гистологического исследования. Блокада CB2R усугубляла токсический эффект Que, поскольку

о чем свидетельствует окрашивание HE и PSR в морфологии. (F) Рассчитывали HW/TL у мышей, получавших PBS или AM 630. (G, H) Влияние AM 630 (антагонист CB2R) на воспалительную инфильтрацию и фиброз у мышей, получавших PBS или AM

630. Окрашивание HE - окрашивание гематоксилином и эозином. PSR, PicroSirius Red. HW/TL - вес сердца/длина голени.*, p<0,05, **, p<0,01, ***, p<0,001, как указано.
3.8. Агенты CBRs регулировали процесс активации некроптоза

Учитывая, что Que специфически индуцирует некроптотическую гибель клеток, а фармакологическая модуляция CBRs играет защитную роль при его кардиотоксичности, мы проверили, регулируют ли CBRs процесс некроптоза клеток. Сначала мы определили влияние одного агента CBR на некроптоз. В клетках, свободных от Que, однократная обработка JWH-133 (1 мкМ), AM 1241 (5 мкМ), AM 281 (2 мкМ) или Rimo (2 мкМ) не вызвала заметного влияния на некроптоз по результатам вестерн-блот анализа (рис. 8A). При инсульте Que антагонисты CB1R и агонисты CB2R последовательно снижали уровень белка MLKL и ингибировали фосфорилирование MLKL (p-MLKL) (рис. 8B). Более того, антагонисты CB1R были более эффективны, чем агонисты CB2R, в клетках миокарда в отношении уровней белков RIP1 и RIP3 (рис. 8В). Кроме того, транслокация MLKL была визуализирована с помощью иммунофлуоресцентного анализа, и было показано, что любой из оцениваемых агентов (JWH-133, AM 1241, AM 281 или Rimo) восстанавливал плазменное расположение MLKL, что значительно противоречило клеткам, подвергшимся воздействию Que, которые демонстрировали явное мембранное расположение MLKL (рис. 8C). Мультиплексный анализ IHC также выявил
Только Que вызывал транслокацию MLKL на клеточную мембрану (черная стрелка), а RIP3 (розовый сигнал)

и повышение уровня MLKL (коричневый сигнал). Предварительная обработка одним из вышеуказанных агентов CBR (JWH-133, AM 1241, AM 281 или Rimo) замедляла повышение MLKL и стабилизировала уровень MLKL в плазме крови (рис. 8D). Все эти данные позволили предположить, что полезные агенты CBRs подавляли процесс некроптоза клеток, вызванный Que.




Рис. 8. Благотворные агенты CBRs подавляли процесс некроптоза клеток. (A, B) Исследуемые защитные агенты (антагонисты CB1R и агонисты CB2R) предварительно обрабатывали клетки HL-1 без Que (A) или с Que (2 мкМ) (B) в течение 24 ч. Через 24 ч проводили вестерн-блот-анализ для выявления некроптоза (верхние панели). Интенсивность
количественная оценка с помощью ImageJ (нижние панели). (C) Анализ иммунофлуоресценции показал, что антагонисты CB1R или
Агонисты CB2R блокировали цитомембранную локализацию MLKL, индуцированную Que (2 мкМ). (D) Мультиплексный IHC-анализ маркеров некроптоза RIP3 (розовый) и MLKL (коричневый) на предметных стеклах сердца из указанных групп. Черный

Стрелка указывает на коричневый сигнал (MLKL) в мембране, красная стрелка - на сигнал RIP3. CBR - каннабиноидный рецептор; Rimo - римонабант. *, p<0,05 по сравнению с Ctrl. #, p<0,05 по сравнению с Que.


4. Обсуждение
Кветиапин является атипичным антипсихотическим препаратом благодаря своему свойству эффективно выполнять фармакологические функции, однако в последние годы он привлекает внимание клиницистов и настороженно назначается из-за своего побочного действия, особенно в отношении миокарда (Coffey and Williams, 2011; Melada et al., 2016; Perlis, 2007). Как и в случае с другими антипсихотиками, кардиотоксичность, вызванная Que, клинически проявляется в виде удлинения интервала QTc, тахикардии и даже внезапной сердечной смерти (Papazisis et al., 2012; Wassef et al., 2015). Патоморфологически лекарственное повреждение миокарда неспецифично и проявляется воспалением
инфильтрация и/или накопление фиброза, которые в состоянии болезни называются миокардитом и кардиомиопатией.

В настоящем исследовании для создания мышиной модели кардиотоксичности Que использовалась клинически сопоставимая доза Que для непрерывного введения мышам. По сравнению с группой, получавшей плацебо, воздействие Que вызывало значительное накопление воспалительных клеток и усугубление фибротических поражений вокруг сосудов и в интерстиции миокарда, о чем свидетельствовали окрашивание HE и окрашивание PSR. При увеличении продолжительности воздействия или концентрации доз Que значительно снижал жизнеспособность кардиомиоцитов.
Клетки, подвергшиеся воздействию кветиапина, демонстрировали некротические морфологические изменения под электронным микроскопом. Все эти экспериментальные данные подтвердили вызванную кветиапином сердечную токсичность in vivo и in vitro.
Основное воздействие токсичности лекарств заключается в том, чтобы вызвать гибель клеток (Linkermann and Green, 2014).

Кардиомиоциты, обработанные Que, показали нарушение целостности мембраны, набухание митохондрий и расширение ретикулума, что является показателем некротической гибели клеток. Таким образом, были выявлены определенные в настоящее время типы клеточной смерти, включая клеточный апоптоз, аутофагию и некроптоз, которые запрограммированы и передают сигналы по определенным путям. Как показали результаты, Que вызывал активацию основных медиаторов некроптоза клеток, но оказывал непоследовательное воздействие на другие белки, участвующие в апоптозе и аутофагии. Que активировал некроптоз кардиомиоцитов наиболее стабильно по сравнению с Clz и Olz, двумя другими атипичными антипсихотиками. Поскольку некроптоз, как было документально подтверждено, участвует во многих токсических эффектах лекарств, а его фармакологическое ингибирование обеспечивает защиту от токсических эффектов лекарств (Linkermann and Green, 2014; Xu et al., 2018; Yuan and Kaplowitz, 2013), in vivo был использован специфический ингибитор Nec-1. Предварительная обработка Nec-1 действительно подавляла процесс некроптоза. Nec-1 значительно ослаблял сердечный
Отек и патологическое ремоделирование, определяемые по соотношению HW/TL, и значительно подавляли

Que-индуцированные фиброзные поражения (p<0,01). Эти данные подтвердили терапевтический потенциал Nec-1 при сердечно-сосудистых заболеваниях.
Стоит отметить, что предварительное лечение Nec-1 не помогло снять обострение воспалительных клеток после инсульта Que. Это может быть объяснено недостатками клинического применения Nec-1. Nec-1 был первым соединением, идентифицированным как ингибитор некроптоза путем аллостерического нацеливания на RIP1 (Degterev et al., 2008). Однако метаболическая стабильность Nec-1 очень ограничена (T1/2 <5 мин в микросомальном анализе мыши) (Degterev et al., 2013; Teng et al., 2005). Позднее было отмечено, что Nec-1 обладает
и выявлено, что он также ингибирует индоламин-2,3-диоксигеназу (IDO, также известную как IDO1), которая является ферментом, участвующим в метаболизме триптофана (Takahashi et al., 2012). В этом случае оптимизированные аналоги Nec-1, такие как 7-Cl-O-Nec-1, будут представлять собой более эффективный инструмент, чем Nec-1, благодаря его T1/2 ~1 ч в микросомальном анализе печени и исключительной селективности в отношении RIP1 (Degterev et al., 2013; Teng et al., 2005).
Кроме того, идентификация предшествующих регуляторов клеточного некроптоза поможет найти новые фармакологические мишени для разработки лекарств. Как большое семейство рецепторов клеточной поверхности, рецепторы, связанные с G-белками, привлекают широкое внимание, и более 30 % современных коммерческих лекарств разработаны путем воздействия на рецепторы, связанные с G-белками. Каннабиноидные рецепторы принадлежат к суперсемейству рецепторов, связанных с G-белками, и были названы привлекательным терапевтическим подходом для лечения сердечно-сосудистых заболеваний (Martin et al., 2018). В предыдущем исследовании мы сообщили, что два подтипа CBRs (CB1R и CB2R) были критически вовлечены и играли противоречивые роли в Clz-индуцированном повреждении миокарда (Li et al., 2019). Здесь мы также обнаружили, что основные эндоканнабиноиды (AEA и 2-AG) снизили свои уровни при инсульте Que. CB1R интернализовался, в то время как CB2R оставался на поверхности клетки после инсульта Que, что указывает на противоположный способ, которым CBR передают внеклеточный сигнал.
Фармакологическое ингибирование CB1R или селективная активация CB2R обеспечивали надежную защиту от токсичности Que, о чем свидетельствовало уменьшение воспалительной инфильтрации и фибротических поражений в сердцах. В частности, антагонисты CB1R (Rimo, AM 281) или агонисты CB2R
(JWH-133, AM 1241) подавляли процессы активации некроптоза после обработки Que. Эти данные убедительно свидетельствуют о том, что CBRs являются регуляторами некроптоза. CBRs опосредовали
Que-индуцирует сердечную токсичность, регулируя процесс некроптоза.
Интересно, что антагонисты CB1R или агонисты CB2R значительно снижали соотношение HW/TL, индекс сердечного воспаления и степень фиброза - три показателя сердечной дисфункции. Для сравнения,

Nec-1, ингибитор некроптоза, показал лишь незначительное подавление индекса инфильтрации. Одним из объяснений может быть очень короткий период полураспада Nec-1 (Weinlich et al., 2017). Больший размер группы также может помочь обосновать эффективность Nec-1. Дополнительная интерпретация может заключаться в том, что полезные агенты CBRs превосходят по терапевтической эффективности RIP1-таргетированные малые молекулярные ингибиторы.
Фармакологические ингибиторы некроптоза эволюционировали, и были разработаны улучшенные версии Nec-1 с более длительным периодом полураспада или более высокой специфичностью (Weinlich et al., 2017). К сожалению, ни один из этих ингибиторов не нашел идеального клинического применения. Фармакологические модуляторы CBRs, однако, добились большого прогресса в клиническом применении. Хотя препарат Римо был снят с производства из-за его высокой склонности вызывать психиатрические побочные эффекты, такие как большие депрессивные эпизоды
(Sherafat-Kazemzadeh et al., 2013), идентификация антагонистов CB1R/агонистов CB2R дает нам уникальную возможность предположить, что фармакологическое воздействие на CBR может обеспечить благоприятный эффект при лекарственной кардиотоксичности. Таким образом, потенциальные преимущества антагонистов/агонистов CBR заслуживают дальнейшего изучения и открывают новые терапевтические возможности для разработки лекарств.
Следует отметить, что настоящее исследование выявило противоположное влияние CB1R и CB2R на кардиотоксичность Que, то есть антагонисты CB1R или агонисты CB2R оказывали кардиопротективное действие. Это напомнило консультантам, что не стоит использовать двойной антагонист или двойной агонист CB1R, так как двойное связывание может нейтрализовать эффект друг друга. Терапия должна быть основана на монорецепторах.
5. Заключение
В настоящем исследовании впервые была установлена кардиотоксичность, вызванная Que, in vivo и in vitro, и на основе экспериментальных моделей было установлено, что Que способствует некроптотической гибели клеток, вызывая сердечную токсичность. Селективные антагонисты CB1R или селективные агонисты CB2R обеспечивают благоприятный потенциал против кардиотоксичности, вызванной Que.

Декларация интересов

? Авторы заявляют, что у них нет известных конкурирующих финансовых интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, представленную в данной статье.

? Авторы заявляют о следующих финансовых интересах/личных отношениях, которые могут рассматриваться как потенциальные конкурирующие интересы:

Конфликт интересов
Авторы не заявляют о конфликте интересов.


Благодарности

Работа выполнена при финансовой поддержке Национального фонда естественных наук Китая (гранты №: 81701861 и 81871525), Китайского фонда постдокторской науки (гранты №: 2016M601507 и 2018T110348) и Фонда стипендий Чжэнъи Школы фундаментальных медицинских наук Фуданьского университета (грант №: s22-10).

Ссылки
Адамеова А., Хрдличка Й., Шоби А., Фаркасова В., Копаскова К., Мурарикова М., Некар Й., Колар Ф., Равингерова Т., Дхалла Н.С., 2017. Доказательства некроптоза в сердцах, подвергшихся различным формам ишемических инсультов. Can J Physiol Pharmacol 95, 1163-1169.
Cai, Z., Jitkaew, S., Zhao, J., Chiang, H.C., Choksi, S., Liu, J., Ward, Y., Wu, L.G., Liu, Z.G., 2014.
Транслокация через плазматическую мембрану тримеризованного белка MLKL необходима для TNF-индуцированного некроптоза. NAT CELL BIOL 16, 55-65.
Коффи, С., Уильямс, М., 2011. Кветиапин-ассоциированная кардиомиопатия. N Z Med J 124, 105-107.
Коултер, Д.М., Бейт, А., Мейбум, Р.Х., Линдквист, М., Эдвардс, И.Р., 2001. Антипсихотические препараты и расстройства сердечной мышцы в международном фармаконадзоре: исследование на основе анализа данных. BMJ 322,
1207-1209.
Дегтерев А., Хитоми Ж., Гермшайд М., Ч'Эн И.Л., Коркина О., Тенг X., Эббот Д., Куни Г.Д., Юань К., Вагнер Г., Хедрик С.М., Гербер С.А., Луговской А., Юань Ж., 2008. Идентификация киназы RIP1 как специфической клеточной мишени некростатинов. NAT CHEM BIOL 4, 313-321.
Дегтерев, А., Маки, Дж.Л., Юань, Дж., 2013. Активность и специфичность некростатина-1, мелкомолекулярного ингибитора киназы RIP1. КЛЕТОЧНАЯ СМЕРТЬ 20, 366.
Дун, X., Ли, Л., Й., Чжан, Д., Чжэн, Л., Цзян, Й., Шэнь, М., 2018. Количественное определение основных эндоканнабиноидов в цельной крови с помощью жидкостной хроматографии-тандемной масс-спектрометрии на основе суррогатных аналитов. BIOMED CHROMATOGR, e4439.
Дрюс, Дж., 2000. Открытие лекарств: историческая перспектива. НАУКА 287, 1960-1964.
Дю Плесси, С.С., Агарвал, А., Сириак, А., 2015. Марихуана, фитоканнабиноиды, эндоканнабиноидная система и мужская фертильность. J Assist Reprod Genet 32, 1575-1588.
Фернандес-Руис, Х., Ромеро, Х., Рамос, Х.А., 2015. Эндоканнабиноиды и нейродегенеративные расстройства: Болезнь Паркинсона, хорея Хантингтона, болезнь Альцгеймера и другие. Handb Exp Pharmacol 231, 233-259.
Герра, Г., Заимович, А., Герра, М.Л., Чиккочиоппо, Р., Чиппителли, А., Серпеллони, Г., Сомаини, Л., 2010. Фармакология и токсикология производных каннабиса и эндоканнабиноидных агонистов. Recent Pat CNS Drug Discov 5, 46-52.
Гонг, Й.Н., Гай, К., Кроуфорд, Дж.К., Грин, Д.Р., 2017. Биологические события и молекулярная сигнализация после активации MLKL во время некроптоза. КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ 16, 1748-1760.
Гупта, К., Фан, Н., Ванг, К., Лю, Б., 2018. Некроптоз при сердечно-сосудистых заболеваниях - новая терапия

цель. J MOL CELL CARDIOL 118, 26-35.
Хуанг, Р., Лю, В., 2015. Выявление существенной роли ядерного LC3 для аутофагии. АУТОФАГИЯ 11, 852-853.
Якобсен, К.Д., Валлах-Кильдемоес, Х., Брун, К.Х., Хашеми, Н., Пагсберг, А.К., Финк-Йенсен, А., Нильсен, Й., 2017. Неблагоприятные события у детей и подростков, получавших кветиапин: анализ сообщений о неблагоприятных лекарственных реакциях из базы данных Датского агентства по лекарственным средствам. Int Clin Psychopharmacol 32, 103-106.
Ли, С.Х., Ким, Х.Р., Хан, Р.Х., Окани, Р.К., Джин, Д.И., 2013. Оценка сердечно-сосудистого риска атипичных антипсихотических препаратов на модели зебрафиш. J APPL TOXICOL 33, 466-470.
Li, L., Dong, X., Tu, C., Li, X., Peng, Z., Zhou, Y., Zhang, D., Jiang, J., Burke, A., Zhao, Z., Jin, L., Jiang, Y., 2019. Противоположные эффекты каннабиноидных CB1- и CB2-рецепторов на антипсихотический препарат клозапин-индуцированную кардиотоксичность. Br J Pharmacol 176(7), 890-905
Li, L., Ye, X., Zhao, Z., Gao, P., Jiang, Y., 2018. Упущенные из виду смертельные инфекционные заболевания после длительного приема антипсихотиков у пациентов с психическими заболеваниями. SCHIZOPHR RES 195, 258-259.
Линкерманн, А., Грин, Д.Р., 2014. Некроптоз. N Engl J Med 370, 455-465.
Мартин, Г.В., Норьега, С.Е., Кассуха, Д.Е., Фуэнтес, Л.Б., Мануча, В., 2018. Анандамид и эндоканнабиноидная система: привлекательный терапевтический подход к сердечно-сосудистым заболеваниям. Ther Adv Cardiovasc Dis 12, 177-190.
Мелада, А., Крчмар, Т., Видович, А., 2016. Дозозависимая связь между кветиапином и интервалом QTc. INT J CARDIOL 222, 893-894.
Папазисис, Г., Мастрогианни, О., Чатциниколау, Ф., Василиадис, Н., Райкос, Н., 2012. Внезапная сердечная смерть в результате передозировки кветиапина. Psychiatry Clin Neurosci 66, 535.
Перлис, Р.Х., 2007. Лечение биполярного расстройства: эволюционирующая роль атипичных антипсихотиков. AM J MANAG CARE 13, S178-S188.
Пертви, Р.Г., 2015. Эндоканнабиноиды и их фармакологические действия. Handb Exp Pharmacol 231, 1-37.
Рош-Эли, Д., Ван Эйнзидель, Р., Катофер, С., Шванингер, М., Вайсброд, М., 2002. Миокардит, вызванный кветиапином. Am J Psychiatry 159, 1607-1608.
Ромао, С., Мунц, К., 2014. LC3-ассоциированный фагоцитоз. АУТОФАГИЯ 10, 526-528.
Сальво, Ф., Париенте, А., Шакир, С., Робинсон, П., Арно, М., Томас, С., Раски, Э., Фуррье-Реглат, А., Мур, Н., Стуркенбум, М., Хазелл, О.Б.О.И., 2016. Внезапная сердечная и внезапная неожиданная смерть, связанная с приемом антипсихотиков: Мета-анализ обсервационных исследований. CLIN PHARMACOL THER 99, 306-314.
Шерафат-Каземзаде, Р., Яновский, С.З., Яновский, Я.А., 2013. Фармакотерапия детского ожирения: настоящее и перспективы. Int J Obes (Lond) 37, 1-15.
Стэк, Е.К., Ванг, К., Роман, К.А., Хойт, К.К., 2014. Мультиплексная иммуногистохимия, визуализация и количественная оценка: обзор с оценкой усиления сигнала Tyramide, мультиспектральной визуализации и мультиплексногоанализа . METHODS70, 46-58.
Szobi, A., Rajtik, T., Adameova, A., 2016. Влияние некростатина-1, ингибитора некроптоза, и его неактивного аналога Nec-1i на базальную сердечно-сосудистую функцию. PHYSIOL RES 65, 861-865.
Такахаши, Н., Дюпрез, Л., Гроотянс, С., Каувельс, А., Неринкс, В., Дюхадауэй, Ж.Б., Гуссенс, В., Роландт, Р., Ван Хаувермейрен, Ф., Либерт, К., Деклерк, В., Каллеваерт, Н., Прендергаст, Г.К., Дегтерев, А., Юань, Ж., Ванденабеле, П., 2012. Аналоги некростатина-1: критические вопросы специфичности, активности и использования in vivo в экспериментальных моделях заболеваний. CELL DEATH DIS 3, e437.

Тенг, X., Дегтерев, А., Джагтап, П., Синг, X., Чой, С., Дену, Р., Юань, Ж., Куни, Г.Д., 2005.
Исследование взаимосвязи структуры и активности новых ингибиторов некроптоза. BIOORG MED CHEM LETT 15, 5039-5044.
Трейнор, К., 2009. Советники FDA опасаются расширять применение кветиапина: клиницисты высказывают опасения по поводу метаболических эффектов, поздней дискинезии. Am J Health Syst Pharm 66, 880, 882.
Вьюег, В.В., 2003. Антипсихотические препараты нового поколения и удлинение интервала QTc. Prim Care Companion J Clin Psychiatry 5, 205-215.
Вассеф, Н., Хан, Н., Мунир, С., 2015. Миокардит, вызванный кветиапином, протекающий как острый STEMI. BMJ Case Rep 2015.
Вайнлих, Р., Оберст, А., Бир, Х.М., Грин, Д.Р., 2017. Некроптоз в развитии, воспалении и болезни. Nat Rev Mol Cell Biol 18, 127-136.
Ву, К.С., Цай, Ю.Т., Цай, Х.Дж., 2015. Антипсихотические препараты и риск желудочковой аритмии и/или внезапной сердечной смерти: общенациональное перекрестное исследование. J AM HEART ASSOC 4.
Xie, X., Zhao, Y., Ma, C.Y., Xu, X.M., Zhang, Y.Q., Wang, C.G., Jin, J., Shen, X., Gao, J.L., Li, N.,
Sun, Z.J., Dong, D.L., 2015. Диметилфумарат индуцирует некроптоз в клетках рака толстой кишки через истощение GSH/увеличение ROS/путь активации MAPKs. Br J Pharmacol 172, 3929-3943.
Xu, Z., Jin, Y., Yan, H., Gao, Z., Xu, B., Yang, B., He, Q., Shi, Q., Luo, P., 2018. Опосредованный белком группы высокой подвижности бокс 1 некроптоз вносит вклад в кардиотоксичность, вызванную дазатинибом. TOXICOL LETT 296, 39-47.
Юань, Л., Капловиц, Н., 2013. Механизмы лекарственно-индуцированного повреждения печени. CLIN LIVER DIS 17, 507-518.
Zhou, F., Jiang, X., Teng, L., Yang, J., Ding, J., He, C., 2018. Некроптоз может быть новым механизмом гибели кардиомиоцитов при остром миокардите. MOL CELL BIOCHEM 442, 11-18.